真菌培养及其他真菌检测方法

真菌培养

真菌培养检查是将待测标本在一定温度和湿度下进行培养，2-4周后根据生长真菌的菌落形态和镜下结构进行菌种鉴定。临床上常用真菌培养基有沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、马铃薯培养基(PDA)。SDA是将葡萄糖40ｇ、蛋白胨10ｇ、琼脂18-20g加入烧杯或铝锅内，加少量蒸馏水加热溶解，待完全溶解后补足蒸馏水至 1000ｍＬ，分装试管，115℃ 10min高压灭菌。SDA主要用于临床真菌常规培养。PDA即把铃薯200g，洗皮切成碎块，加水煮沸20min，纱布过滤，滤液中加入琼脂20g，葡萄糖20g，加热使之溶化，再补足蒸馏水至1000mL，分装，高压灭菌。PDA可用于真菌的培养及曲霉菌和青霉菌的鉴定。此外，还有许多常用的培养基。

改良沙氏琼脂培养基

根据不同用途可以将沙氏琼脂培养基进行改良，加入维生素Ｂ0.1mg/mL，可以促进紫色毛癣菌和断发毛癣菌生长繁殖；加入酵母浸膏5mg/mL，可促进皮肤癣菌生长。

 科马嘉显色培养基

科马嘉显色培养基是一种新型的鉴定培养基， 能对临床常见的假丝酵母菌进行分离并根据菌落的颜色快速鉴定常见菌种。根据培养基上生长菌落的颜色和形态进行判断：绿色菌落为白色假丝 酵母菌即白念珠菌，蓝灰色菌落为热带念珠菌，粉 红色、边缘模糊、有微毛的为克柔念珠菌，紫红色为 光滑念珠菌，白色为其他念珠菌属。对于混合感染 的标本，也可以根据菌落在培养基上呈现的不同颜 色作出判断。用科马嘉显色培养基快速鉴定常见念珠菌属，目前已广泛应用于临床真菌培养。

米饭培养基

米饭培养基即按１g大米、３mL水的比例放入试管或培养皿中，121℃ 15min高压灭菌备用。可用于鉴别非典型的羊毛状小孢子菌和奥杜盎小 孢子菌，还能促进许多皮肤癣菌产生其特征性分生 孢子，有助于菌种鉴定。

玉米粉吐温琼脂

玉米粉吐温琼脂即将玉米粉50g 混于水中， 65℃水浴1h，过滤，蒸馏水补足100mL，再加入葡萄糖2g、琼脂15g、吐温-80，121℃ 10min高压灭菌后分装，冷却后冰箱保存。它能促进红色毛癣 菌产生深红色色素，可用于红色毛癣菌的鉴别。如 不加葡萄糖，玉米粉吐温琼脂可用作念珠菌鉴定的 小培养，以促进白念珠菌假菌丝和厚壁孢子的形 成，也会促进暗色孢科真菌孢子的形成。

尿素琼脂

尿素琼脂是将葡萄糖10g、蛋白胨1g、NaCl 5ｇ，KH2PO4 2g,0.02%酚红水溶液６ｍＬ，蒸馏水1000ｍＬ 混匀后调pＨ 至6.8，加入琼脂20g，煮沸至琼脂完全溶解，10min高压灭菌，取出后冷却至45-50℃时，每450ml培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50mL，混合均匀后分装斜面，冷却后备用。新生隐球菌等一些隐球菌和一些酵母能够产生尿素酶，而许多其他酵母却不能产生尿素酶，尿素酶能分解培养基中的尿素，并形成大量的氨，使培养基pH值升高而呈碱性，使酚红指示剂变红，因此尿素琼脂可用于隐球菌的鉴定。另外皮肤癣菌的尿素酶试验用含５％ 葡萄糖的此培养基， 用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌。

其他

除上述培养方法，常用的培养基还有咖啡酸琼脂，用于鉴别新生隐球菌；芽管实验培养基，可鉴定白念珠菌；脑心浸膏琼脂(BHI)，双相真菌可在该培养基上呈酵母相；卡菌鉴定培养基，鉴定奴卡菌与链霉菌；葡萄糖酵母汁蛋白胨液体基，可分离培养酵母菌；子囊琼脂、石膏块培养基，可培养酵母菌产生子囊孢子；Leeming和Notman培养基、橄榄油培养基、七叶苷琼脂可用于培养鉴定马拉色菌；皮肤癣菌鉴别琼脂，用于鉴定皮肤癣菌等等。

真菌检测方法的新进展

针对真菌感染，除了通过真菌培养菌落特征来鉴别常见菌种，目前有越来越多的新的真菌检测方法，在检测是否有真菌感染、抗真菌药物有效性及准确鉴定各种菌种等方面起到了重要作用。

分子生物学检测

目前，常用的分子生物学分型方法有很多，包括多聚酶链式反应(PCR)、分子杂交、随机扩增片段长度多态性、脉冲场凝胶电泳、限制性片段长度多态性聚合酶链反应、多位点序列分析、重复序列PCR、实时荧光定量PCR、任意引物聚合酶链反应、单链构象多态性分析、DNA序列分析、基因芯片技术等。

质谱技术

20世纪80年代以来，有４种软电离质谱技术产生，分别为等离子体解吸质谱技术、基质辅助激光解吸电离技术、快原子轰击质谱技术和电喷雾质谱技术。在此基础上，相关衍生和串联技术也不断产生。它通过直接检测生物标志物（蛋白）鉴定病毒、细菌、真菌及分枝杆菌，具有高敏感性、高通量和快速的特点。不同真菌通过质谱仪得到不同的蛋白质图谱，与数据库进行比对，根据图谱的匹配度，得出鉴定结果和相应的鉴定分值，分值越高匹配度越好，结果越可信。因此，质谱法准确性依赖数据库中菌株种类，实验室需不断更新和补充数据库。质谱技术在酵母菌属鉴定应用比较广泛，数据库已包括了大量临床酵母菌的参考图谱，

常用于鉴定常见酵母菌（白假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、克柔假丝酵母和近平滑假丝酵母），准确率高。有研究等发现质谱仪对以下丝状真菌鉴定效果较好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癣菌、镰刀菌、木霉和毛霉目，特别是临床常见的曲霉菌。但是数据库中只有少量的丝状真菌参考图谱，标本的制备程序复杂还需改进。另外，丝状真菌的图谱很容易受到真菌不同阶段的产物包括孢子、子实体、表面菌丝和基内菌丝体等的影响。

其 他

此外，真菌药敏试验、组织病理、微生物自动鉴定系统、隐球菌荚膜抗原检测、循环抗原检测、循环抗体检测、外抗原实验、皮肤实验等方法也可用于真菌感染的检测和鉴定。

目前，对于皮肤及甲的真菌感染，最常用的还是真菌镜检和培养，荧光染色因其操作简单、快速、灵敏度高的优点也开始广泛应用于临床。对于深部及皮下组织真菌感染，组织病理是诊断的金标准。Ｇ试验、ＧＭ试验和隐球菌荚膜抗原检测是目前临床常用的真菌血清学试验。分子生物学、流式细胞术等先进的诊断试验由于种种原因，在我国各级医院尚未能顺利展开。新兴的质谱技术及其相关衍生和串联技术凭借其快速、操作简单、稳定可靠等优点，相信在未来临床致病真菌鉴定中将具有很大优势。随着科研人员的不断研究和科技的不断进步，会有越来越多的技术应用于真菌的检测，为临床诊断和治疗提供指导。