双光子成像技术简介

双光子显微镜是现代重要的光学显微镜，具有3D成像、活体动物成像、检测灵敏度高、空间定位性高、光漂白和光损伤低等特点，在生物学、神经科学等领域中广泛运用。中医药是我国历史悠久且具有独特理论及技术方法的医学体系，在治疗临床疾病中发挥着不可或缺的作用。中医药领域已经开展了大量中医药临床与基础研究，来阐述中医药治疗的作用及机制。目前最大的问题是创新性和准确性不足，因此结合现代科学技术是推动中医药现代化发展的关键。双光子显微镜在中医药研究中的细胞成像、组织成像、在体成像中得到广泛运用，使中医药研究实现“可视化”创新，提供了更科学、更直观的证据。本文对双光子显微镜技术发展和优势，以及其在中医药领域的细胞网络、组织结构、活体成像等方面的应用进行阐述，并展望其更广阔的应用前景。

双光子显微镜的发展

1990年，Denk等将双光子激发现象应用到荧光显微镜中，发明了第一台双光子显微镜。初代的双光子显微镜在技术方面有单一成像、采集频率不足、体积较大等缺点。近年来，为了突破单一成像的技术限制，Jér6meLecoq团队在2014年研发出一种可以同时在大脑2个区域进行成像的双光子显微镜，可以观察小鼠2个脑区之间的相互作用。其后MengkeYang等研发了一种多区域的双光子实时体内探索器，这种探索器可以很容易对体内多区域神经元进行探索，可以研究全脑的神经环路。DanielBarson团队最新研发出一种可以同时观察局部神经元功能和整个大脑网络的正交轴显微镜，其中介观显微镜位于大脑上方，双光子物镜则位于水平方向，这样可以同时进行介观和双光子成像。这种方法也能够识别远距离皮层网络的椎体神经元和表达血管活性肠肽的中间神经元的行为状态相关的功能连接。为了更好地监视神经元的活动，了解大脑中的信息处理过程，JianglaiWu等研发出一种每秒高达3000帧和亚微米的空间分辨率成像的双光子显微镜，该设备可以检测固定的清醒小鼠大脑表面以下345μm的超阈值和亚阈值电活动。TongZhang团队相继研发了一个具有400个照明光束的双光子显微镜，该显微镜以高达1kHz的速率共同采集95000~211000μm2的区域，可以在清醒小鼠的大脑中观察到微循环血流、快速静脉收缩和神经元钙离子的增高，并具有毫秒级的定时分辨率。而为了使双光子吸收更有效，To-moakiKinjo等研发出一种名为2paCRY2的CRY2变体，该蛋白可以通过蓝色荧光蛋白的共振能量转移被双光子激发更有效的激活，使双光子激发效率更高。

以上的技术发展都使双光子显微镜在成像速度更快、分辨率更高和激发更有效等方面提高。而从传统的双光子显微镜发展到微型双光子显微镜更是使该技术得到质的飞跃。双光子显微镜创始人Denk团队在2001年研制出第一代的微型双光子显微镜，为该方向奠定了理论基础。接着各个研究团队在微型双光子显微镜的分辨率和头戴重量等相关技术上不断改进更新。2017北京大学的程和平院士团队研制出新一代的微型双光子显微镜。

该团队设计了新型920nm空心光子晶体光纤和高速双轴微机电扫描仪等最新配件，最重要的是该微型双光子显微镜重量只有2.2g，可以实现多探头佩戴和多颅窗不同脑区的长时间监测。并且这种微型双光子显微镜能研究更多样的动物行为，例如亲子护理、社交等社交行为或者进食和睡眠等自然行为。

双光子吸收是指在强光激发下，递质分子吸收第一个光子达到虚能级之后，在飞秒时间内收第二个光子，获得足够的能量，从而跃迁到达激发态的过程。双光子吸收是目前在生物学标本中应用最为广泛的非线性光学效应。由于具有这种特殊的光学效应，双光子显微镜已经被运用到各个领域，包括从分子到网络，细胞到组织，离体到在体以及生理病理等多个层次。从细胞成像开始，PhilippeBousso等通过双光子显微镜对胸腺培养物中的胸腺细胞发育和细胞接触进行了实时分析。接着，利用双光子显微镜技术具有成像深度深和光毒性低的特点，MichaelD.Cahalan等发现双光子显微镜与指示剂分子的结合可以阐释淋巴器官组织中的T细胞和B细胞的编排，可以揭示免疫应答基础的细胞协同作用。JingW.Wang等则在2003年运用双光子显微镜结合钙成像技术揭示了果蝇中可以被气味激活的大脑活动图谱。从此，双光子在体成像技术更多运用到神经科学的领域。在神经元和胶质细胞成像中，有研究发现听觉感觉皮层中神经元组的回声反应优先发生在接近神经元最佳频率的的地方，还有研究建立了长时间监测清醒猕猴的皮层神经元钙信号，另有研究发现胡须刺激和微脉管刺激会影响皮层星形胶质细胞的钙离子信号。在树突和树突棘成像方面，北京大学深圳研究生院的甘文标团队首次用双光子显微镜证明了大脑皮质的大部分树突棘稳定存在于生命过程。该团队在后续的研究中还证明大脑皮质的树突棘是作为长期信息存储的结构基础。双光子显微镜还可用于监测小鼠皮层中间神经元的树突形态。在血管成像中，结合荧光标记技术可以将老鼠耳朵皮肤深度超过100μm的3D血管清晰地显示出来，从而提供整个血管网络的信息。

除上述应用以外，近年来双光子显微镜还与光遗传、化学遗传和光纤记录等技术在神经科学领域被广泛结合运用。例如结合光纤记录技术，在双光子显微镜下发现抗抑郁药物可能通过选择修复前额叶皮质的树突棘发挥作用。利用光遗传学原理，用双光子显微镜本身的激光对神经环路进行闭环刺激，可以实现在行为学实验中“实时”操纵神经环路;对眼额叶皮质的有关喂养和社交的神经元进行5秒的光刺激可以促进喂养和社交行为。结合化学遗传技术，研究发现社会刺激可以诱导下丘脑室旁核内催产素神经元的激活，以促进雄性小鼠的社会行为。

双光子显微镜的特性与优势双光子显微镜在细胞成像、组织成像和在体成像研究中都具有不同的优势和特点。对于细胞成像来说，典型的双光子脑部系统通常能够达到亚微米级的空间分辨率，能够满足细胞精细结构的成像的研究。例如用追踪单个细胞的方法了解嗅球中的球旁细胞的迁移过程。在组织成像研究中，光毒性和光漂白性低对于组织来说十分重要。双光子的激发发生在焦点附近，使其激发光可以穿透更深的标本，同时光毒性和光漂白性也低。这种特性适合于进行各部分组织结构和动力学研究。例如，有研究将其运用于观察基底细胞癌和恶性黑色素瘤等不同病变皮肤的形态学特征;有研究发现子宫黏膜中的CD8+常驻记忆细胞可以独立于局部记忆或者淋巴组织增生而自主调节局部免疫监测。在活体成像研究中，双光子显微镜系统通常采用波长较长的红外激光作为激发光源，这种光源的波长在生物组织中具有较好的穿透性，可以达到数百微米的成像深度。所以它可以在活体内实现对分子事件的动态、实时、连续监测，并且能够揭示生物分子的相互作用过程的时间、空间关系。适用于上述列举的神经元和胶质细胞成像、树突和树突棘成像和血管成像等。