双光子成像技术在中医药研究中的应用

目前，双光子显微镜技术在中医药研究中已经涵盖了细胞、组织及活体成像，见下表。

在细胞成像研究中，发现相关的中药大分子可以促进癌细胞的凋亡，为中医药治疗癌症提供实验依据。在组织成像研究中，双光子显微镜观察中药提取物和方剂对肾脏、肝脏、肠组织的影响，结果显示中药提取物和方剂可以有效改善肾小球肾炎、肝纤维化、慢性炎性肠病等临床疾病。为了更准确阐释中医药治疗疾病的临床疗效，相关的活体动物研究是必不可少的。在活体成像研究中，研究者运用双光子显微镜观察中药提取物和方剂对脑血管疾病和阿尔兹海默症疾病模型的影响，明确了中医药在脑血管疾病和神经系统疾病中的作用，同时，也证明针灸可以升高穴位附近肌肉的Ca2+水平。

下面将从细胞成像、组织成像、活体成像3个方面论述双光子显微镜在中医药领域中的应用。

中医药应用中的细胞成像

利用双光子显微镜进行的细胞网络成像具有以下4个优点:1)具有单细胞甚至亚细胞分辨率;2)可以同时记录到上百甚至更多个神经细胞的活动;3)能够明确记录每个细胞的相对位置以及细胞类型;4)结合电生理方法，可以将神经元的活动精确到单个动作电位。因此双光子显微镜技术被广泛运用到中药、方剂等相关的细胞研究中。

中药在临床上治疗癌症时有很好的疗效，但是各类中药主要的作用成分和机制还不够明确。双光子显微镜在中药研究中的最早应用是研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用。天花粉蛋白是从中草药瓜蒌根中提取的一种核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤和抗HIV作用。张春阳等应用双光子显微镜结合特异性荧光探针首次观察到天花粉蛋白诱导人绒癌细胞凋亡过程中活性氧自由基和细胞内钙离子的变化。结果显示天花粉蛋白诱导的钙离子升高和自由基的形成参与了其诱导人绒癌细胞的凋亡过程，且自由基的形成与钙离子升高有关。该研究也为后续中医药领域的细胞研究建立了一种在单细胞层次适时、无损伤、多参数观察活细胞的方法。

接着，在相关中药诱导癌细胞的后续研究中，缪冬映发现中药苦参、山豆根等的主要成分苦参碱能够通过抑制重要的信号通路，抑制结肠癌细胞生长，并且能够诱导结肠癌细胞发生凋亡。其研究应用双光子显微镜观察细胞的凋亡，结果发现加入苦参碱后结肠癌细胞培养在不同时间点均出现明显的生长抑制，并随着药物浓度的提高和时间的延长而增强。

中医药应用中的组织成像

双光子显微镜组织成像的标本有很多种类，例如肾、肝、心、肠和脑等。同时双光子显微镜所需的特殊激发光可以控制分子荧光开关技术用于活体荧光成像，从而获得焦平面15nm的分辨率，对亚细胞结构有很好的分辨率，而其极低的组织损伤也使得很多生物过程得以长时间观察，是中医药研究组织形态学的一大优势。

苦豆子是一味具有清热解毒、祛风除湿疗效的中药，常用于治疗痢疾、湿疮等疾病。氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的成分，是苦参碱的N-氧化物。柴宁莉等运用双光子显微镜技术观察经尾静脉注射红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞8周后的肝脏组织，发现氧化苦参碱和骨髓间充质干细胞联合观察组的肝脏脂肪变和纤维化程度减轻，肝细胞脂肪变和坏死较轻。同时检测血清发现联合观察组的ALT、AST水平也更低。结果表明氧化苦参碱协同骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的效果优于这2种药物单独使用，且未出现不良反应，这给临床治疗肝纤维化提供新的途径。同样，雷公藤作为治疗风湿顽痹的要药，在现代临床中也常用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征等肾脏疾病。雷公藤甲素是雷公藤中最重要的活性成分，在雷公藤治疗肾病的机制中成为研究热点。李亚妤等先后在2个研究中证实了雷公藤甲素对局灶节段硬化性肾小球肾炎(FSGS)的治疗效果以及相关的机制。2个研究中采用切除5/6肾制备FSGS模型，均分为雷公藤低、中、高剂量组和模型组。研究通过观察各组大鼠一般情况和尿蛋白定量变化以及在双光子显微镜下观察肾组织病理形态等指标，结果显示雷公藤甲素可以明显增加FSGS大鼠总体生存率，而组织切片雷公藤甲素各组与对照组相比大鼠肾皮质uPAR、β3整合素表达增强，且高剂量组优于低剂量组。该研究中还发现μPAR和β3整合素对足细胞损伤具有调控作用，而足细胞损伤在FSGS疾病中发挥了重要的作用，所以该观察组再后面的研究主要证实Synaptopodin蛋白在雷公藤甲素治疗FSGS的作用。同样通过双光子显微镜观察疾病模型大鼠的肾脏组织切片病理形态变化及尿蛋白等指标，发现雷公藤甲素确能减少FSGS肾病大鼠模型24h尿蛋白定量以及保护肾功能。而相关机制与雷公藤甲素能上调Synaptopodin蛋白的表达，减少肾组织足细胞的损伤有关。

方剂在中医药治疗疾病的效果十分显著，但是同样在机制方面缺乏直接的科学证据。双光子显微镜在经方的研究中也发挥着重要的作用。参苓白术散是《太平惠民和济局方》中的名方，主要治证由脾虚致湿所致。在已证实参苓白术散可以减轻慢性炎性肠病(IBD)症状，同时可以改善肠上皮黏膜屏障的基础上，游宇等通过双光子显微镜观察IBD小鼠模型的肠组织切片的自噬及相关蛋白表达情况，发现参苓白术散明显改善IBD小鼠的隐血、便血和病理改变等，且增加肠上皮细胞的自噬，进一步证实参苓白术散抗IBD的作用与其调节肠上皮细胞的自噬有关。

中医药应用的活体成像

活体光学成像主要是采用生物发光和荧光2种技术。双光子使用红外波段的超快激光作为光源，利用光学非线性效应实现对样品的三维、四维甚至实时监测。由于红外光对生物组织的杀伤作用相对较小，因此研究者可利用此技术对生物样品进行活体动态观察。同时，由于长波长的长激光在组织中具有很高的穿透深度，双光子显微镜自诞生以来是目前应用最广泛的活体脑光学成像方法。对于血管相关疾病和癌症的研究和治疗学，非常需要在颅内发展穿透深度深和高信噪比的体内荧光成像，以观察血管内形态和血流动力学。在中医药领域，双光子显微镜已有血管疾病和神经疾病的相关应用。

谭莉萍等制备大鼠急性血瘀模型后，采用双光子活体成像技术，对小鼠脑血管闭塞-溶栓过程进行实时监测，并观察血液流变学及凝血功能等指标。结果显示银杏叶提取物在血液流变性、凝血功能、血管内皮功能、炎性反应应答及氧化应激等方面具有调控作用，能够促进脑部微血管栓塞部位的血液流动，加快栓块溶解。提示银杏叶提取物可有效防治脑部和周围血流循环障碍。在同样中医药治疗大脑血管疾病的研究中，ShenLiu等通过制备永久性局灶性中动脉阻断脑缺血模型(pMCAO)，在双光子显微镜下观测微血管结构和脑内微循环。结果显示在小鼠大脑中动脉永久阻断后6或24h，通心络胶囊可改善神经功能缺损，减少梗死面积，减弱血脑屏障破坏，保护微血管结构，增加毛细血管流速和体积流量，抑制白细胞-内皮细胞的相互作用，且治疗效果呈剂量依赖性。同样，另一研究在双光子显微镜下发现血栓通可以提高APP/PS1小鼠的脑血流量，且淀粉样的斑块减小。这表明相关中医药有望成为治疗阿尔兹海默症的有效方案。在针灸相关的研究中，GengLi等在小鼠后肢肌肉中转染GCaMP2cDNA2周后，在麻醉状态下固定小鼠之后针刺足三里，通过双光子显微镜检测Ca2+水平。结果显示由针刺的机械运动产生的声切波可以使小鼠后肢肌肉的Ca2+增加。

小结

双光子显微镜在中医药研究中发挥巨大的优势。1)双光子显微镜能够观察在使用各类中药提取物后细胞甚至亚细胞水平上的细胞结构形态、细胞运动、分子相互作用等现象和过程进行直接的成像监测，已用于中药提取物对于肿瘤细胞的作用及其机制研究。2)因其具有光漂白性和光毒性小的优势，在各种中药及方剂研究肾脏、肝脏和肠组织中已得到有效运用。3)活体成像方面，中医药研究证明银杏叶提取物和通心络胶囊可以治疗血管类疾病;血栓通可以作为治疗阿尔兹海默症的潜在方案;而针灸也被证明可以提高相应穴位附近肌肉的Ca2+水平。综上所述，双光子显微镜作为现代最重要的光学显微镜，已经广泛运用到与中医药有关的细胞、组织和活体成像研究中。双光子显微镜技术与中医药研究的结合，可以为中医药治疗疾病提供更科学直观的证据，还可以阐释更多的中医基础理论，加快中医药现代化发展的进程。